Хроматографический анализ

История и принцип метода.

           В 1903 г. молодой русский ботаник Михаил Цвет изучал входящее в состав растений органическое вещество – хлорофилл. Цвет предполагал, что хлорофилл - смесь нескольких неизвестных структурнородственных соединений. Для их разделения Цвет не мог использовать высокотемпературные методы (например, дистилляцию), так как хлорофилл разрушался. Разделение не удавалось осуществить и с помощью уже известных в то время методов осаждения или экстракции:  компоненты хлорофилла слишком сходны по своим свойствам. Поэтому Цвет решил пропустить при комнатной температуре раствор хлорофилла через стеклянную трубку (колонку), заполненную порошком мела. Вначале в верхнюю часть колонки вносили небольшое количество хлорофилла, а затем пропускали через колонку  чистый органический растворитель – петролейный эфир. Компоненты хлорофилла проходили через колонку  медленнее, чем эфир, причем скорость движения разных компонентов была различной. Через некоторое время внутри колонки можно было наблюдать узкие зоны с разной окраской. Постепенно окрашенные зоны  перемещались вниз по колонке и разделялись участками, где окрашенные вещества отсутствовали (рис.1).  Распределение окрашенных зон по длине колонки Цвет назвал хроматограммой.

Вытолкнув столбик мела из колонки, Цвет вырезал из него окрашенные зоны и экстрагировал из каждой соответствующий компонент хлорофилла для дальнейших исследований. Таким образом, задача быстрого и полного разделения смеси структурно-родственных веществ без применения высоких температур и химических реагентов была успешно решена.

 

 

 

 

 

 

 

 

                  Рис. 1  Схема опыта Цвета по хроматографическому разделению хлорофилла.

              А – начальный момент, Б – неполное разделение, В – полное разделение, Г - после разделения.

 

           

Разделение компонентов смесей при их движении через твердую фазу ранее наблюдали и другие исследователи, но только М.С.Цвет понял значимость этого явления для аналитической химии. В своих докладах и статьях Цвет указывал, что речь идет о принципиально новом методе разделения любых смесей, а не только о частной проблеме анализа хлорофилла. М.С.Цвет назвал этот метод хроматографией (от греческих слов хроматос – цвет и графо - писать) и  предсказал, что хроматографию можно будет использовать для быстрого разделения не только окрашенных, но и бесцветных веществ; в том числе компонентов газовых смесей. Для полного разделения смеси достаточно будет даже небольшого различия в адсорбционных свойствах компонентов. К сожалению, при жизни Цвета, умершего в 1919 г., новый метод не получил признания.

         В 30-е годы ХХ века исследователи из разных стран вновь обратились  к  проблеме разделения смесей, особенно смесей органических веществ. Были созданы новые варианты хроматографии (это не умаляет роль Цвета как первооткрывателя метода в целом). В частности, было предложено вместо экстракционного извлечения компонентов из соответствующих зон внутренней хроматограммы  - полностью вымывать компоненты элюентом. Так как они выходят из колонки по очереди, в разное время, их можно собирать в отдельные приемники. Было показано также, что делить компоненты смесей можно не только в колонке, но и в тонком плоском слое сорбента (тонкослойная хроматография).

Большой вклад  в теорию и практику хроматографического анализа в 40-х и 50-х годах внесла группа исследователей, которой руководил английский аналитик А.Мартин. В 1952 г. Мартин и Джеймс создали газожидкостную хроматографию. Вскоре  были сконструированы первые приборы для  разделения, идентификации и количественного определения компонентов сложных смесей. Эти приборы назвали хроматографами. Они непрерывно регистрируют некоторое физическое свойство выходящего из колонки газа или раствора, таким образом получается внешняя хроматограмма. Каждый пик на хроматограмме соответствует выходу из колонки одного из компонентов смеси. Положение пика определяется природой компонента и может быть использовано для его опознания. Высота и площадь пика пропорциональны содержанию компонента в смеси, то есть являются аналитическими сигналами. К концу 50-х годов было налажено массовое производство хроматографов, они стали широко использоваться в контрольно-аналитических лабораториях.

Исследования в области хроматографического анализа продолжались  и в последующие годы. К концу ХХ века  хроматография стала важнейшим способом контроля производства. По некоторым оценкам, ныне около 60% всех химических анализов выполняется хроматографическим методом. Особенно широко применяются такие методы в нефтехимии, в пищевой промышленности, в клиническом и фармацевтическом анализе, а также в контроле загрязнения окружающей среды (анализ воздуха, природных и сточных вод). В частности, для определения токсичных металлов в природных водах широко применяют ионообменную хроматографию для контроля состава сложных лекарственных препаратов – жидкостную,  для определения пестицидов и других токсичных веществ - газожидкостную, и т.д. Примером может быть хроматограмма экстракта из мышечной ткани птиц, на которой отчетливо видны пики различных хлорорганических пестицидов (рис.2). Следы пестицидов попали в организм птицы в результате техногенного загрязнения окружающей среды.

                           I

 

 

 

 

 

 

 

 

τ

 
 

 


             Рис. 2.  Небольшой участок хроматограммы экстракта из мышечной ткани

Здесь и далее на осях хроматограмм:  I –сигнал детектора, τ – время с момента ввода пробы. Буквами отмечены пики пестицидов. Всего на хроматограмме  имеется свыше ста пиков.

 

Общие закономерности хроматографии. Варианты хроматографического анализа  многочисленны и весьма различны, но все они имеют два общих признака:

·      хроматографическое разделение  происходит при перемещении смеси (например, анализируемой пробы) сквозь слой неподвижного сорбента. Таким образом, в любом методе есть подвижная фаза (ПФ), проходящая  через неподвижную фазу (НФ). При этом НФ  замедляет перемещение компонентов подвижной фазы (пробы);

·      компоненты пробы обратимо распределяются между ПФ и НФ, причем по мере движения ПФ через НФ процесс распределения многократно повторяется. Компоненты, имеющие разные коэффициенты распределения, движутся с разной скоростью и постепенно разделяются.

Основываясь на этих признаках, введем определение: хроматография – физико-химический метод разделения и анализа, основанный на многократном перераспределении компонентов смеси между двумя фазами - подвижной и неподвижной.

Чем сильнее удерживается некоторый компонент пробы неподвижной фазой, тем медленнее он будет двигаться через нее и тем позже выйдет из колонки с сорбентом. И время удерживания компонента (t) будет больше.

Классификации хроматографических методов.  Методы хроматографического анализа можно классифицировать по разным признакам. Существование нескольких классификаций позволяет быстро охарактеризовать каждую конкретную методику. Так, классический метод Цвета – это адсорбционная колоночная элюентная  жидкостная  хроматография.

  Наиболее важна классификация  по агрегатному состоянию подвижной фазы. В этом случае выделяют методы газовой и жидкостной хроматографии. Более детальная классификация учитывает и природу неподвижной фазы. Так, внутри газовой хроматографии выделяют газожидкостную и газотвердофазную хроматографии, аналогичным образом выделяют разные варианты жидкостной хроматографии.

Учитывая  цель разделения компонентов, выделяют аналитические и препаративные варианты хроматографии. Масса разделяемой смеси в препаративной  хроматографии гораздо больше, чем в аналитической.

Можно учесть технику метода, в частности, способ размещения неподвижной фазы. В колоночной хроматографии неподвижная фаза находится внутри тонкой и длинной колонки, через которую под давлением пропускают газ или жидкость. Частный случай колоночной хроматографии - капиллярная хроматография, в этом случае  длина колонки может достигать нескольких сотен метров при внутреннем диаметре порядка 1 мм. Напротив, в тонкослойной (ТСХ) и бумажной хроматографии неподвижная фаза - плоский слой пористого материала, сквозь который жидкость движется благодаря  силам поверхностного натяжения.

Еще один способ классификации учитывает состав подвижной фазы. В частности, в элюентной хроматографии ПФ - поток непрерывно подаваемого в колонку чистого инертного газа (газа-носителя) или жидкого растворителя (элюента). Именно так делил компоненты хлорофилла М.С.Цвет. Элюентная хроматография ведет к четкому разделению компонентов, но концентрация их  в ходе разделения сильно понижается, что нежелательно. Другие способы хроматографирования (фронтальный  и  вытеснительный) не ведут к сильному разбавлению пробы. В первом случае подвижной фазой служит сама анализируемая смесь, во втором – вспомогательное вещество, которое сильнее поглощается неподвижной фазой, чем все компоненты смеси, и  вытесняет их из колонки. Однако полное разделение компонентов пробы в обоих случаях не достигается. Поэтому  такие варианты в современной практике хроматографического анализа применяют довольно редко. В дальнейшем будет рассматриваться лишь наиболее распространенный метод - элюентная хроматография.

Часто используется классификация методов по механизму разделения веществ. Разная скорость движения компонентов пробы через неподвижную фазу может объясняться:

·         различиями  в адсорбционных свойствах  молекул при их поглощении поверхностью твердой неподвижной фазы (адсорбционная хроматография), 

·         неодинаковой растворимостью компонентов в неподвижной жидкой фазе (распределительная хроматография),

·         разной способностью компонентов  к ионному обмену (ионообменная хроматография),

·         различным размером молекул (молекулярно-ситовая хроматография).

Этот перечень можно продолжать и далее, так как известно около двух десятков разных механизмов взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой, но перечисленные выше четыре механизма встречаются чаще всего. Механизм взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой определяет, какие смеси можно делить в том или ином случае. Например, распределительную газожидкостную хроматографию преимущественно используют для разделения легко испаряемых органических соединений, молекулярно-ситовую – для анализа  природных полимеров (белков,  полисахаридов и т.п.), а ионообменную – для определения ионов в водных растворах. Иногда реальный хроматографический процесс имеет смешанный механизм, возможность разделения компонентов смеси определяется сразу двумя-тремя факторами (например, и размером молекул, и их адсорбционными свойствами).

Механизм взаимодействия компонентов пробы с неподвижной фазой нередко остается неизвестным непосредственным исполнителям анализа, что не мешает им получать точные результаты. Теоретические аспекты разделения веществ являются общими для всех видов хроматографии. Вид и способы обработки хроматограмм, практические приемы проведения качественного и количественного анализа, а иногда и используемая  в ходе анализа аппаратура  - зачастую тоже не зависят от механизма разделения компонентов. Знать его надо в основном  для  разработки новых и оптимизации известных методик анализа.

 

Жидкостная хроматография.

Знакомство с  отдельными методами хроматографического  анализа логично начать с жидкостной хроматографии (ЖХ), так как этот метод исторически возник первым. 

Сорбенты. В жидкостной хроматографии неподвижную фазу образуют мелкодисперсные частицы твердых сорбентов – оксида алюминия, силикагеля, алюмосиликатов, угля, сажи, мела, талька. Используют также природные (целлюлоза, крахмал) или, чаще, специально синтезированные полимерные сорбционные материалы (тефлон и др.). Размер частиц сорбента не превышает 1 мм, чаще используют порошки с еще меньшим размером частиц (десятки микрометров). Для качественного разделения компонентов смеси надо, чтобы все частицы были приблизительно одинакового размера (это достигается с помощью многократного просеивания сорбента через сита с разным размером отверстий). Разделение веществ в ЖХ  чаще всего идет происходит по адсорбционному механизму, в этом случае сорбенты называют адсорбентами.

Адсорбция  молекул или ионов из раствора идет не на всей поверхности твердой частицы, а только на определенных активных центрах этой поверхности. Так, на поверхности оксида алюминия  существуют по меньшей мере три вида активных центров (кислотные, основные и т.п.), адсорбирующих из раствора молекулы разного типа. Примером кислотных центров могут быть группы  Si-O-H  на поверхности силикагеля. В зависимости от способа приготовления и подготовки адсорбента (например, от  способа его промывки реагентами, от температуры и продолжительности прокаливания, и т.п.) можно получить  адсорбент с преобладанием тех или иных центров, с меньшим или большим числом центров на единице поверхности. Такими способами можно получать адсорбенты с заданными свойствами.

 Для разделения  малополярных органических молекул преимущественно используют  полярные адсорбенты типа силикагеля и оксида алюминия, а в качестве элюентов  применяют органические растворители (углеводороды, спирты, эфиры). Для разделения ионов и  сильнополярных органических молекул используют совсем другой набор фаз. А именно, неподвижные фазы - неполярные вещества (крахмал, целлюлоза и т.п.), подвижная фаза – вода, водные растворы кислот, солей или щелочей, водно-спиртовые или водно-ацетоновые растворы. Такой вариант анализа называют обращенно-фазовой хроматографией.

     Классическая адсорбционная жидкостная хроматография (метод Цвета) до сих пор применяется во многих аналитических лабораториях. В этом случае мелкодисперсный сорбент загружают в колонку высотой 1-2 м,  вносят в верхнюю часть колонки пробу и медленно промывают колонку подходящим элюентом. Состав элюента может быть неизменным, но нередко колонку промывают сначала одним элюентом, затем другим, и т.д. На выходе из колонки периодически контролируют состав элюата, измеряя показатель преломления (nd) или другое свойство раствора. В отдельные приемники собирают фракции с разными значениями nd. Так можно разделить какой-либо нефтепродукт, выделяя  сумму предельных (парафиновых) углеводородов, легкие, средние и тяжелые ароматические углеводороды, и т.п.

Классический вариант ЖХ длителен, трудоемок и далеко не всегда обеспечивает полное разделение компонентов. Качество разделения улучшается при уменьшении размера частиц. Поэтому на смену классическому варианту ЖХ  в 70-ые годы XX века пришел метод, в котором применяют сорбенты с гораздо меньшим размером частиц (5-10 мкм) и сравнительно небольшими колонками (длина - 10-30 см, диаметр – порядка 5 мм Поскольку гидравлическое сопротивление колонки с мельчайшими частицами сорбента очень велико, для ускорения анализа элюент нагнетают в колонку под большим давлением, в 100-400 раз выше атмосферного. Для проведения анализа потребуется специальный прибор -  жидкостной хроматограф (рис.3), снабженный мощным насосом и детектором, непрерывно измеряющим свойства элюата. Пробу в хроматограф вводят с помощью специальных кранов-дозаторов. Соединительные трубки и сами колонки выполняют из прочных, химически инертных материалов. Очень важно обеспечить герметическое соединение разных узлов жидкостного хроматографа, которые должно выдержать высокое давление.

Этот вариант анализа получил название: жидкостная хроматография высокого давления (ЖХВД) или высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ). Иногда состав элюента меняют непрерывно (градиентное элюирование), смешивая в переменном соотношении 2-3 растворителя по заранее заданной программе. Такой прием позволяет полностью вымывать из колонки все компоненты пробы и получать на одной хроматограмме пики соединений, сильно различающихся по растворимости (например, растворимых только в воде и растворимых  только в ацетоне).

 

 

                         Рис.3. Принципиальная схема хроматографа для ВЭЖХ

  и 1б - резервуары для растворителей, 2 -смеситель для градиентного элюирования,  3 - кран-дозатор,

4 – термостат с колонкой, 5 –устройство для сбора фракций.

Жидкостные хроматографы оснащают фотометрическими, флуориметрическими, кондуктометрическими или рефрактометрическими детекторами. Контролируя оптическую плотность элюата или интенсивность люминесценции на определенных длинах волн, можно зафиксировать выход некоторых компонентов пробы и рассчитать их содержание,  не фиксируя сигналы других  компонентов. Для записи хроматограмм и их обработки, вплоть до расчета концентрации всех компонентов,  в настоящее время используют компьютерную технику.

Современные жидкостные хроматографы обеспечивают высокую точность анализа. Пределы обнаружения  компонентов анализируемой смеси зависят от их природы и еще более от типа используемого детектора, они могут составлять 10-9  и даже 10-10 г. Однако столь высокая чувствительность и точность анализа требуются далеко не всегда. С другой стороны, дорогие и сложные жидкостные хроматографы доступны не всем  аналитическим лабораториям. Очевидно, кроме метода ВЭЖХ, нужны другие, более простые и дешевые варианты жидкостной хроматографии, которые, тем не менее, позволят быстро разделить исследуемую смесь и опознать ее компоненты. Задача имеет два решения – это методы тонкослойной  и бумажной хроматографии.

Тонкослойная хроматография (ТСХ).  Метод был предложен в 1938 г. Измайловым и Шрайбер. Здесь на плоскую пластинку, поверхность которой покрыта тонким (до 1 мм) слоем твердого мелкозернистого сорбента, наносят каплю разделяемой смеси (≈ 0,01 мл).

А                                                                                                           Б

1           2        3         4         5

 
   Стеклянная камера

                                              Пластинка с

                                            сорбентом

 


                                        

                                         Сосуд с элюентом

 

 


                   Рис. 4. Схема выполнения (А) и результат (Б) разделения смеси методом ТСХ.

На стартовую линию были нанесены: предполагаемые компоненты пробы порознь (1-4) и сама проба (5), содержащая на самом деле компоненты 1 и 3.  Стрелкой показано направление движения элюента.

 

. В наиболее распространенном варианте ТСХ нижний край пластинки погружают в растворитель (элюент). За счет капиллярных сил элюент перемещается вверх по слою сорбента, увлекая за собой растворимые компоненты пробы. Чтобы элюент не испарялся с поверхности сорбента, пластинка на время разделения должна быть помещена в герметически закрытую прозрачную камеру (рис.4).

  При правильном выборе ПФ и НФ, а также при достаточно малом объеме пробы каждый компонент движется в виде небольшой зоны («пятна»), и эти пятна не расплываются по поверхности сорбента. Когда фронт элюента приблизится к верхнему краю пластинки, ее вынимают из хроматографической камеры, высушивают и определяют положение пятен на полученной внутренней хроматограмме. Если компоненты пробы не окрашены, хроматограмму проявляют, облучая УФ-светом, обрабатывая парами иода или другими реагентами.  После проявления будет наблюдаться столько пятен, сколько компонентов с разными коэффициентами распределения изначально присутствовало в пробе.

 

           Для идентификации компонентов в методе ТСХ пользуются следующими приемами:

1)   Сравнение со свидетелями. В этом случае рядом с каплей пробы на стартовую линию наносят капли «свидетелей» - предполагаемых компонентов пробы (химически чистые индивидуальные вещества или их растворы в ПФ). Последующее совпадение по высоте подъема (а также по окраске) какого-либо пятна пробы и пятна свидетеля указывает на возможное присутствие соответствующего вещества в пробе, хотя и не гарантирует этого (разные вещества могут иметь совпадающие окраски и совпадающие высоты подъема). Для подтверждения проверку проводят повторно, в новых условиях - с другими сорбентами, с другим растворителем. Случайное совпадение характеристик свидетеля и компонента пробы в нескольких системах маловероятно.

 2)  Сравнение с табличными подвижностями. Величина подъема пятна – Rf , не зависит от размера пластинки, времени разделения и (при достаточно малой массе пробы) от концентрации компонента в пробе и присутствия других компонентов, то есть это идентификационная характеристика. Для часто применяемых систем ПФ - НФ подвижности индивидуальных веществ известны и собраны в таблицы. Сравнение с табличными значениями Rf  - удобный и  быстрый метод идентификации, особенно если в лаборатории отсутствует нужный свидетель или вообще не ясно, какие свидетели использовать, поскольку неизвестен даже ориентировочный состав пробы.

3) Обработка селективными реагентами. Окраска или свечение пятен могут возникать или меняться при обработке хроматограммы реагентами. Так, некоторые углеводы и аминокислоты имеют совпадающие значения Rf , но при опрыскивании хроматограммы нингидрином пятна аминокислот синеют, а углеводы с этим веществом не реагируют.

4) Спектрофотометрическая идентификация. Сорбент в соответствующей зоне аккуратно снимают с пластинки и переносят в сосуд, где обрабатывают растворителем. Затем раствор с извлеченным компонентом отфильтровывают и снимают его спектр, например, спектр поглощения в УФ-области против чистого растворителя. По спектру судят о химической природе компонента. В отдельных случаях снимают спектр самого пятна (с помощью специальных приборов спектры отражения или спектры флуоресценции можно снимать непосредственно на пластинке). Эти же приемы используют и для количественного анализа.

         Вместо пластинок с нанесенным  тонким слоем сорбента  можно использовать полоски или листы специальной бумаги (типа фильтровальной). Остальные операции в методе  бумажной хроматографии проводятся примерно так же, как и в тонкослойной. Для разделения на бумаге веществ, растворимых в воде (например, неорганических ионов), в качестве ПФ берут органический растворитель, а бумагу заранее смачивают водой. Для разделения  компонентов, хорошо растворимых в органических растворителях, бумагу заранее пропитывают подходящим органическим растворителем, а  в качестве подвижной фазы берут воду, водный раствор какой-либо кислоты или щелочи. Еще лучше использовать буферный раствор с известной величиной рН, так как при разделении  веществ, способных участовать в процессах протолиза. Величина рН водной фазы  сильно влияет на величину Rf .

            7Газовая хроматография

        В жидкостной хроматографии с поверхностью неподвижной фазы (НФ) взаимодействуют не только компоненты разделяемой пробы, но и растворитель; это мешает разделению. В этом отношении существенные преимущества имеет газовая хроматография: газ-носитель, пропускаемый через колонку и переносящий компоненты пробы в виде их паров, практически не взаимодействует с НФ. Есть два основных варианта газовой хроматографии, различающиеся по природе неподвижной фазы и по механизму разделения компонентов пробы. 

·      газотвердофазная или, как ее чаще называют, газоадсорбционная хроматография (ГАХ).

·      газожидкостная хроматография (ГЖХ).

Для проведения анализа методами ГАХ или ГЖХ используют одни и те же приборы – лабораторные газовые хроматографы. С практической точки зрения отличия связаны лишь с заполнением колонок тем или другим сорбентом. Но возможности этих методов, их области применения - весьма различны.

Практическое применение методов газовой хроматографии. В газоадсорбционной хроматографии колонку заполняют твердым сорбентом, на поверхности которого будут обратимо адсорбироваться компоненты пробы.

ГАХ – лучший метод разделения и анализа легких  неорганических газов, в частности  компонентов воздуха, инертных газов, оксидов азота и серы. При комнатной температуре хорошо определяются СО, СО2 и легкие углеводородные газы. Хорошо разделяются неполярные вещества.

        В газожидкостной хроматографии колонка содержит неподвижную жидкую фазу (НЖФ), нанесенную на поверхность твердого инертного сорбента или на внутреннюю поверхность самой колонки (капиллярной).. Компоненты пробы  двигаются медленнее, чем газ-носитель, поскольку  растворяются в НЖФ, а затем вновь извлекаются из нее новыми порциями газа-носителя. Если коэффициенты распределения компонентов пробы между газом-носителем и НЖФ  неодинаковы, они движутся через колонку с разной скоростью, разделяются и выходят из колонки поочередно.

ГЖХ – незаменимый метод анализа жидких нефтепродуктов. Но температура кипения всех компонентов пробы не должна превышать 350 0С, а при испарении не должны идти химические реакции. На хроматограмме бензина можно увидеть десятки пиков разных индивидуальных углеводородов; на хроматограмме керосина или дизельного топлива – несколько сотен пиков. Но метод ГЖХ нельзя применить для анализа асфальта или тяжелого мазута, поскольку  испарение этих нефтепродуктов потребует настолько высоких температур, что компоненты пробы начнут окисляться и разрушаться (пиролиз).

Другая важная область применения ГЖХ - анализ объектов окружающей среды. Например, так определяют пестициды в почвах и биообъектах,  ароматические углеводороды (бензол, толуол и т.п.) в воздухе, и т.п.

Устройство и принципы работы газового хроматографа. В схему любого газового хроматографа (рис.7.8) входят: 1 - баллон с газом-носителем (азотом или гелием), 2 - блок подготовки газа-носителя, 3 – дозатор (испаритель), 4 - колонка, 5 – термостаты испарителя и колонки, 6 – детектор,  7 - регистрирующая аппаратура (самописец, интерфейс и т.п.). Подготовка газа-носителя подразумевает его очистку от микропримесей. Одновременно  устанавливают необходимые значения давления газа и скорости его движения через колонку. Точно измеренный объем жидкой (или, реже, газообразной) пробы быстро вводят в поток газа с помощью шприца, прокалывая им резиновую прокладку и отмечая момент ввода пробы в испаритель. Другой способ ввода - использование специальных кранов-дозаторов. Обычно объем жидкой пробы- от 0,5 до 10 мкл.

                   Рис.7.8. Схема газового хроматографа.

Сплошными линиями показано движение газа, пунктиром – передача электрического сигнала.

 

В испарителе создается температура, намного более высокая, чем температура кипения наименее летучего компонента пробы. После испарения компоненты пробы попадают в хроматографическую колонку. Колонки изготавливают из инертных материалов (медь, сталь, стекло, кварц). Колонки могут быть насадочными или капиллярными. Насадочные колонки изогнуты в виде U-образной трубки или спирали, они сравнительно короткие (до 6 м) и широкие (внутренний диаметр – менее 1 см). Внутри насадочной колонки находится мелкодисперсный сорбент (носитель с нанесенной на его поверхность НЖФ). Капиллярные колонки имеют гораздо большую длину (до 500 м, обычно 50-100 м) и меньший диаметр (1-2 мм), чем насадочные. Такие колонки являются гибкими, и их наматывают на специальные катушки. НЖФ наносят на внутренние стенки капиллярной колонки. 

 

 Способы качественного и количественного хроматографического анализа   

      Во всех  вариантах колоночной хроматографии (ГЖХ, ВЭЖХ, ГАХ, ИОХ и т.п.) используют  практически одни и те же  способы качественного, а также  количественного анализа сложных смесей. Это объясняется тем, что анализ проводится по хроматограмме пробы, а  хроматограммы, получаемые во всех  этих методах, однотипны. Рассмотрим способы проведения качественного и количественного анализа  на примере самого распространенного метода, а именно -  метода газожидкостной хроматографии.

Качественный анализ.  На  хроматограмме пробы сложного состава можно увидеть десятки и даже сотни пиков.  Разобраться, какое именно химическое соединение  соответствует тому или иному пику, довольно трудно,  а  ошибка может привести к опасным последствиям. Для  расшифровки хроматограмм  можно использовать характеристики удерживания предполагаемых компонентов,  это самый простой, хотя и не самый надежный способ. Известно, что характеристики удерживания   для данной методики хроматографирования  определяются  только природой компонента (его температурой кипения, молекулярной массой, наличием определенных функциональных групп в молекуле и др.). Характеристики удерживания весьма специфичны, они могут различаться даже у ближайших изомеров. Именно поэтому хроматографисты используют характеристики удерживания  в качестве идентификационных признаков. 

Хорошим способом проверки присутствия некоторого вещества в пробе является следующий прием:  пробу хроматографируют два раза, первый раз без добавки,  а второй раз с добавкой  вещества, присутствие которого в пробе проверяется. Если  на  второй хроматограмме окажется столько же пиков, сколько на первой, причем один из пиков заметно увеличится по высоте и площади, это укажет на присутствие проверяемого вещества в пробе (или другого, но с тем же временем удерживания!).

Иногда состав пробы совершенно неизвестен, и не ясно, с какими эталонами надо сопоставлять хроматограмму этой пробы. С другой стороны, в лаборатории может  не  оказаться  эталонных веществ - предполагаемых компонентов пробы. Полный набор эталонов не может иметь ни одна лаборатория – число известных химических соединений слишком велико! В обоих случаях ни один из вышеперечисленных  способов качественного хроматографического анализа реализовать не удастся. Выходом из положения может быть использование  табличных значений характеристик удерживания.  Начиная с 70-х годов XX  века, хроматографисты собирают данные по характеристикам хроматографического удерживания разных веществ для наиболее известных неподвижных фаз (таблицы, справочники, атласы, компьютерные базы данных). Существуют сравнительно небольшие базы данных (БД) по характеристикам удерживания однотипных объектов, в частности, пестицидов, наркотиков, углеводородов и т.п., их применяют для расшифровки качественного состава соответствующих проб. Для анализа проб неизвестного состава создаются  универсальные банки данных, содержащие информацию по десяткам и даже сотням тысяч органических веществ. Естественно,  просмотр больших БД требует применения быстродействующих компьютеров и  специального программного обеспечения. Надежность идентификации по табличным данным ограничена неполнотой справочных данных -  в пробе всегда могут оказаться  вещества, сведения о которых отсутствуют в используемой БД.  

 Количественный анализ. Сигналом, связанным с концентрацией компонента в пробе,  обычно служит площадь пика (S) на хроматограмме. В качестве аналитического сигнала можно использовать и высоту пика. Какой вариант расчета концентраций (по площадям или по высотам) приведет к  более точным результатам анализа, зависит от типа используемого детектора и вида хроматограммы.

    

Hosted by uCoz